На основі комплексних (цитоморфологічних, цитохімічних, імуноцитохімічних) досліджень розроблений алгоритм діагностики мієлоїдних новоутворень (МН) і мієлодиспластичних синдромів (МДС). Цитоморфологічна і цитохімічна діагностика МН і МДС (передлейкозів) базується на оцінці стану кістковомозкового кровотворення при первинному дослідженні мазків із пунктатів кісткового мозку (наявність однолінійної або мультилінійної дисплазії, підрахунок кількості бластів) та виявленні активності кислої неспецифічної естерази в клітинах системи мононуклеарних фагоцитів (промоноцитів, моноцитів, гістіоцитів, макрофагів) при МДС.
Диференційна діагностика проводилася у 139 хворих з підозрою на хронічний мієлопроліферативний та мієлодиспластичний процес. Враховуючи клініко-лабораторні дані та результати цитоморфологічних досліджень препаратів периферичної крові та кісткового мозку серед хворих цієї групи у частини пацієнтів проводилося молекулярно-генетичне дослідження для виявлення специфічної мутації в гені JAK2V617F. У 56 пацієнтів за клініко-лабораторними і морфоцитологічними даними був запідозрений МДС. Для верифікації 18 випадків рефрактерної анемії з надлишком бластів двох типів (РАНБ-1 і РАНБ-2) застосовувалися специфічні мкАт до комітованих мієлоїдних клітин-попередників і зрілих клітин мієлоїдного ряду (CD34, CD38, MPO, HLA-DR, CD117, CD33, CD13, CD14, CD15, CD11b). Для верифікації клітинної форми бластної кризи ХМЛ в 6 випадках застосовувалися відповідні панелі мкАт до антигенів Т-лімфоцитів (СD3, CD4, CD5, CD8), В-лімфоцитів (CD10, CD19, CD37, CD38, CD20, CD22, CD25), клітин-попередників і зрілих клітин мієлоїдного ряду (CD34, CD13, CD15, CD16, CD43, CD45).
При цитоморфологічній верифікації хронічної фази хронічного мієлолейкозу (ХМЛ) та диференціації цієї форми МН від хронічного мієломоноцитарного лейкозу враховують наявність еозинофільно-базофільної асоціації на фоні зсуву лейкоцитарної формули крові вліво без ознак дисплазії кісткового мозку і відсутність моноцитозу.
Цитоморфологія кісткового мозку при ХМЛ в хронічній фазі. Забарвлення за Папенгеймом. Зб. х 1000.
Цитоморфологія кісткового мозку при ХММЛ. Забарвлення за Папенгеймом. Зб. х 1000.
Для верифікації бластного кризу ХМЛ застосування цитохімічних методів, разом із звичайними способами паноптичного забарвлення мазків крові і кісткового мозку, дозволяє попередньо встановити природу лейкемічних клітин. При найбільш поширеному мієлоїдному підваріанті бластного кризу ХМЛ в лейкемічних клітинах визначається позитивна реакція при виявленні активності мієлопероксидази і нафтол-AS-D-хлорацетатестерази, слабке дифузне пофарбування цитоплазми клітин при визначенні активності кислої фосфатази і негативна реакція при виявленні активності кислої неспецифічної естерази. Встановлення мієлоїдної або моноцитарної природи бластних клітин можливо на основі виявлення експресії антигенів CD13, CD14, CD15, CD33. Взаємодія з мкАТ до антигенів CD41 і CD61, до глікофорину і гемоглобіну А дозволяє ідентифікувати бластні клітини з ознаками клітин мегакаріоцитарного і еритробластичного ряду відповідно.
Бластний криз ХМЛ за мієлоїдним типом. Забарвлення за Папенгеймом. Зб. х 1000
При лімфоїдному варіанті бластного кризу ХМЛ у бластних клітинах не виявляється активність МПО, а при PAS-реакції відмічають відкладення глікогену у вигляді великих гранул або блоків. У більшості випадків лімфоїдного бластного кризу ХМЛ лейкемічні клітини представлені трансформованими клітинами-попередниками В-лімфоцитів, на поверхневих мембранах яких виявляється експресія В-лінійних антигенів CD10, CD19 і CD20, а в ядрах клітин - термінальна дезоксинуклеотидилтрансфераза.
Бластний криз ХМЛ за лімфоїдним типом. Забарвлення за Папенгеймом. Зб. х 1000
Для імуноцитохімічної ідентифікації бластних клітин при двох формах МДС (РАНБ-1, РАНБ-2) застосовували специфічні моноклональні антитіла, в тому числі і вітчизняного виробництва, до антигенів гемопоетичних клітин-попередників і зрілих клітин мієлоїдної природи (CD34, CD117, CD38, CD33, CD13, CD15, CD11b). Було з’ясовано, що на бластних клітинах при РАНБ-1 і РАНБ-2 не виявлялася експресія лімфоїдних маркерів (CD19, CD22, cyt/sCD3), а експресія антигену оліголінійних та ранніх клітин-попередників лімфо- та мієлопоезу CD7 асоціюється з поганим прогнозом захворювання.
Співвиконавцем проекту є відділ молекулярної генетики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, співробітники якого проводили молекулярно-генетичні дослідження з метою диференційної діагностики різних форм МН. У відділі молекулярної генетики ІМБіГ вже було розроблено тест-системи для виявлення генетичних перебудов у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію та множинну мієлому, які були впроваджені для діагностики у кількох онкогематологічних відділеннях м. Києва.
Для підтвердження ХМЛ на різних фазах розвитку захворювання при стандартному цитогенетичному дослідженні визначали t(9;22)(q34.1;q11.21), а у випадку залучення молекулярно-генетичних методів за допомогою ЗТ-ПЛР ідентифікували злитний химерний ген BCR-ABL, що присутній в усіх клітинах патологічного клону.
При виявленні кількісних та якісних аномалій в клітинах еритроїдного та мегакаріоцитарного паростків кровотворення в кістковому мозку (збільшення кількості ерітроцитів, їх анізоцитоз і пойкілоцитоз, наявність гіпохромних і/або мікроцитарних форм), тромбоцитозу (з атиповими, крупними та гіпогранулярними тромбоцитами), аномальних форм мегакаріоцитів (мікромегакаріоцити, промегакаріоцити, голі ядра мегакаріоцитів, гігантські форми мегакаріоцитів з гіпердольчатими ядрами і широкою цитоплазмою) і їх кластерів, лейкоцитозу в крові, коли були всі підстави запідозрити одну з форм МН (справжню поліцитемію, ессенціальну тромбоцитемію або первинний мієлофіброз), для підтвердження діагнозу застосовували молекулярно-генетичні методи виявлення мутації гена JAK V617F.
Таким чином, для первинної діагностики основних форм МН (хронічної фази і фази акселерації ХМЛ, справжньої поліцитемії, ессенціальної тромбоцитемії або первинного мієлофіброзу) і МДС на першому етапі мають застосовуватися цитоморфологічні і цитохімічні дослідження клітин крові та кісткового мозку.
На етапі уточнення діагнозу (прецизійної діагностики) бластної кризи ХМЛ, деяких форм МДС (РАНБ-1 і РАНБ-2) і МН – імуноцитохімічні дослідження і молекулярно-генетичні методи для доказу специфічних генетичних порушень в клітинах патологічного клону (у випадку ХМЛ – детекція злитого гена BCR-ABL1; у випадку справжньої поліцитемії, ессенціальної тромбоцитемії або первинного мієлофіброзу - мутації JAK2 V617F).
Виходячи з результатів науково-методичних розробок співробітників ІМБІГ НАНУ, запропоновані конкретні процедури виявлення за допомогою молекулярно-генетичних методів деяких нових мутацій у хворих на МПН, зокрема мутацій гена Calr на доповнення до визначення мутацій JAK2, що дозволить значно поліпшити якість диференційної діагностики деяких форм МПН, розпізнавання яких стикається із значними труднощами у клінічній практиці лікувальних закладів гематологічного профілю в Україні.
Координація наукової діяльності з питань практичного застосування алгоритму діагностики проводилась з клініцистами-гематологами двох гематологічних відділень клінічної лікарні №9 м. Києва, Київського обласного онкодиспансера, а також лікарями-онкогематологами обласних клінічних лікарень України.
Проведена перевірка специфічності МКАТ виробництва ІЕПОР методом проточної цитофлуориметрії з урахуванням особливостей експресії антигенів на лініях клітин або клітинах периферичної крові. За її результатами встановлена можливість використання МКАТ, отриманих в ІЕПОР, за допомогою методів імуноцитохімії.